VCC?1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定(一)

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作者：牟霞, 陈瑶, 王穗海, 黄湘, 李明

【摘要】 　　目的: 构建pcDNA3.1(-)/V?1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC?7721中。方法: 以SMMC?7721细胞总RNA为模板, 通过RT?PCR扩增V?1基因编码区cDNA, 并将扩增的cDNA片段与pMD19?T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后, 用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC?7721, 经G418筛选并建立稳定的转染细胞株, 应用RT?PCR及Western blot检测转染前后该细胞株V?1基因的表达。结果: pcDNA3.1(-)/V?1经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确, 真核表达载体构建成功; 经RT?PCR及Western blot检测, 重组质粒转染株的V?1基因的表达水平高于对照组, 证实V?1基因稳定转染到SMMC?7721细胞中并得到表达。结论: 成功地建立了人基因V?1的肝癌细胞SMMC?7721稳定转染株, 为进一步研究V?1的功能奠定了基础。

【关键词】 V?1; 载体构建; 转染

　　V?1（VEGF correlated chemokine 1）基因是新近发现的一个趋化因子, 被命名为VEGF相关的趋化因子1, 该基因编码119个氨基酸, 含有6个半胱氨酸残基, 其中4个分别位于2个CXC结构域中, 目前列为CXCL17。研究发现V?1在乳腺癌、 结肠癌中高表达, 并与血管形成相关, 在肿瘤的发生发展中可能扮演重要角色〔1〕。为了研究V?1基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响, 我们将V?1 基因克隆构建到真核表达载体上, 并稳定转染到SMMC7721肝癌细胞中。

　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 大肠杆菌DH5α和人肝癌细胞系SMMC?7721均由本实验室保存, pMD19?T载体购自大连宝生物工程有限公司, M?MLV逆转录酶购自Promega公司, 各种分子克隆工具酶购自MBI公司, 脂质体Lipofectamine2000、 TRIzol试剂、 G418和pcDNA3.1(-)真核表达载体购自 Invitrogen公司, RPMI1640、 胎牛血清(FBS)等购自GibcoBRL公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 SMMC?7721总RNA的提取 按照TRIzol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的SMMC?7721, 加TRIzol试剂1 mL, 静置3～5 min。加入氯仿0.5 mL, 混匀。室温静置2～3 min后, 12 000 r/min离心15 min。于上清中加人0.5 mL异丙醇, 室温静置10 min。10 000 r/min离心10 min。弃上清, 加入750 mL/L乙醇1 mL, 7 500 r/min离心5 min, 干燥沉淀, 加入30 μL DEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后, 用紫外分光光度计测定其纯度并定量, 保存于-80℃备用。

　　1.2.2 引物设计 根据GenBank的基因序列(AY358433), 设计扩增V?1编码区cDNA上、 下游引物。上、 下游引物中分别引入Xho I、 BamH I酶切位点, 扩增片段为360 bp。上游5＇?CTCGAGATGAAAGTTCTAATCTCTTC?3＇, 下游 5＇?GGATCAAAGGCAGAGCAAAG?3＇; 内参照β?actin的引物序列为: 上游5＇?TGTGACGTGGACATGCAAAG?3＇, 下游5＇?TGGAAGGTGGACAGCGAGGC?3＇, 扩增片段为206 bp。并设计作为转染SMMC7721细胞后鉴定用的G418抗性基因PGK neo的特异性引物: 上游5＇?AGGATCTTGTCATCTCATT?GCTTG?3＇, 下游5＇?AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA?GGCG?3＇, 扩增片段为492 bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。

　　1.2.3 逆转录合成cDNA逆转录 反应体系为: 细胞总RNA 1 μg, H2O 13 μL, oligdT 0.5 μg, 70℃ 5 min, 立刻冰上放置, 加入M?MLV 200 u, dNTP 10 nmol, 5×M?MLV Buffer 5 μL, Rebinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 25 u, 混匀后42℃ 1 h, 70℃ 10 min。取10 μL反转录产物进行PCR反应, 采用降落PCR (Touch down_PCR), 反应条件: 94℃ 预变性4 min; 94℃变性 30 s, 60℃退火 90 s, 72℃延伸 40 s, 随后每个循环退火温度降低0.5℃, 其他条件不变, 共进行10个循环。然后: 94℃ 30 s, 60℃ 90 s, 72℃ 40 s扩增20个循环, 72℃延伸7 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后, 切胶回收目的片段。

　　1.2.4 T载体克隆 对PCR产物进行割胶纯化, 将目的片段与pMD19?T载体连接。连接反应体系为: Solution I 5 μL, pMD19?T DNA 50 ng, PCR产物50 ng, ddH2O 3 μL, 置于16℃ 2 h后, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态, 在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长, 挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定, 并命名为: pMD19?T/V?1。

　　1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1(-)/V?1的构建 用BamH I、 Xho I分别双酶切重组pMD19?T/V?1质粒及pcDNA3.1(-)空载体, 凝胶电泳后回收目的片段, 16℃连接10 h。连接、 转化, 方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(Invitrogen公司)。测序正确后扩大培养, 抽提重组质粒DNA。

　　1.2.6 细胞培养 SMMC?7721细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的孵箱中培养。

　　1.2.7 SMMC?7721细胞的基因转染和筛选培养 将处于对数生长期的SMMC?7721细胞以4×105个细胞/孔接种于6孔板中, 培养24 h, 使细胞达到80%～90%融合。用脂质体Lipofectamine2000介导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前1 h先予细胞更换无血清培养基, 使细胞适应条件变更。并准备以下2种溶液, A液: 4 μg质粒DNA溶于150 μL无血清培养液中; B液: 4 μL脂质体溶于150 μL无血清培养液中。将A液与B液混匀, 室温孵育30 min, 以形成DNA?脂质体复合体, 加入培养液中。培养8～14 h, 更换为完全培养液, 继续培养24 h, 次日于完全培养液中加入800 mg/L的G418继续进行培养, 2周后G418浓度改为400 mg/L维持筛选。用选择培养液培养4周后, 分离阳性克隆并扩大培养备用。

　　1.2.8 转染后V?1表达的鉴定 分别以β?actin和GADPH为内参照, 对V?1基因在转染细胞内目的基因的mRNA及蛋白表达情况进行鉴定。分别收集稳定转染空载体重组质粒的细胞, 样品处理后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、 转膜、 TBST缓冲液洗膜、 50 g/L脱脂牛奶封闭。一抗为V?1小鼠多抗, 二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG, ECL显色。

　　2 结果

　　2.1 总RNA提取 用一步法成功提取SMMC7721总RNA, 总RNA电泳结果可见有5 S、 18 S和28 S 3条带。

　　2.2 RT?PCR扩增产物的鉴定及真核表达载体的构建与鉴定 SMMC7721总RNA经RT?PCR扩增, 扩增产物电泳结果可见在约360 bp处有一特异性扩增条带(图2), 与预期的扩增片段大小相符。将用BamH I、 Xho I双酶切重组质粒pMD18?T/V?1得到的目的基因插入pcDNA 3.1(-)空质粒, 获得pcDNA3.1(-)/V?1真核表达质粒, 该质粒再经BamH I、 Xho I双酶切鉴定, 得到了360 bp的目的片段和约5 400 bp的载体片段（图1）, 送测序证实该质粒含有完全正确的V?1 cDNA序列。